Protein Expression and Purification

Abstract

SouhrnMetody exprese a purifi kace rekombinantních proteinů umožňují produkci a detailní charakterizaci proteinů v základním výzkumu během in vitro experimentů, ale také přípravu proteinů s terapeutickým využitím.Publikace shrnuje základní postupy od přípravy expresních vektorů až po techniku afi nitní purifi kace.Dále pojednává o vlastnostech různých prokaryotických a eukaryotických expresních systémů a možnostech jejich využití.Molekulární klonování, které slouží k přípravě expresních vektorů pro rekombinantní proteiny, umožňuje cíleně modifi kovat vlastnosti těchto proteinů tak, aby byla usnadněna jejich purifi kace a také pozměněna jejich stabilita, aktivita nebo funkce.V současné době je k dispozici široká škála metodických přístupů, jež umožňují rychlou a efektivní přípravu expresních vektorů.Zvolený produkční organizmus a způsob purifi kace rekombinantního proteinu určují výběr expresního vektoru.První volbou často bývá expresní systém využívající bakterii Escherichia coli, jehož přednostmi jsou zejména technická, časová i fi nanční nenáročnost.Tento expresní systém není příliš vhodný pro produkci komplexních savčích proteinů, pro které jsou optimální expresní systémy založené na využití eukaryotických organizmů (kvasinky, hmyzí buňky nebo savčí buňky).Kultivace hmyzích a savčích buněk je však technicky i fi nančně náročná.Rekombinantní proteiny jsou purifi kovány nejčastěji metodou afi nitní chromatografi e využívající specifi ckou interakci peptidu nebo proteinu s afi nitní matricí.Tyto peptidy či proteiny jsou fúzovány s N-nebo C-koncem purifi kovaného proteinu.Purifi kace probíhá ve třech krocích, kdy je rekombinantní protein prostřednictvím afi nitních značek specifi cky zachycen na matrici chromatografi cké kolony, dále následuje promývací krok, po kterém je uvolněn z kolony čistý protein.